Susanne Wolff, geboren 1973 in Bielefeld, begann nach dem Abitur ein Studium der Literatur, Geschichte und Philosophie, was sie jedoch zugunsten eines Schauspielstudiums abbrach, nachdem sie als Regieassistentin am Bielefelder Theater gearbeitet hatte. Von 1994 bis 1998 studierte sie an der Hochschule für Musik, Theater und Medien in Hannover. Bereits während ihrer Schauspielausbildung hatte sie ihre ersten Bühnenauftritte am Staatsschauspiel der niedersächsischen Landeshauptstadt.

Nach dem Studium erhielt sie ein Engagement am Thalia Theater in Hamburg, wo sie bis 2009 blieb und in zahlreichen Stücken auf der Bühne stand, wobei sie, wie auch heute noch, oftmals starke Frauenrollen übernahm. 1999 wurde sie mit dem Goy-Robert-Preis der Stadt Hamburg geehrt. 2001 gastierte sie in Wien und verkörperte dort Alma Mahler, die "femme fatale" der Kunstszene des frühen 20. Jahrhunderts, in Paulus Mankers "Alma Alma". 2003 spielte Wolff die Hauptrolle in Stephan Kimmigs Inszenierung "Nora" und wurde mit dem 3sat-Preis ausgezeichnet. 2005 gastierte sie erneut in Österreich bei den Salzburger Festspielen in "Penthesilea" unter der Regie von Kimmig, für den sie in Hamburg und seit 2009 in Berlin häufig auf der Bühne stand. Nach dem Wechsel des Intendanten Ulrich Khuon folgte auch Wolffs Umzug nach Berlin an das Deutsche Theater.

Im Hannoveraner Tatort "Heimspiel" (2003) gab Susanne Wolff in einer kleinen Rolle ihr Fernsehdebüt, im gleichen Jahr hatte sie einen Auftritt in der Serie "Broti & Pacek – irgendwas ist immer". 2006 folgte dann ihr Leinwanddebüt in Jan Georg Schüttes zu großen Teilen improvisiertem Drama "Swinger Club", in dem sie eine Frau spielt, deren vergangene amouröse Verwicklungen auf ihrem fünften Hochzeitstag zu Komplikationen zwischen ihr, ihrem Mann und deren Freunden führen. In Justus von Dohnányis Krimikomödie "Bis zum Ellenbogen" (2008) mit Jan Josef Liefers und Stefan Kurt war sie als Rebecca zu sehen. Den gleichen Namen, aber eine andere Rolle erhielt sie in Emily Atefs "Das Fremde in mir" (2008), wo sie die frischgebackene Mutter Rebecca spielt, die ihr Kind als fremd empfindet und um die Bindung kämpfen muss. Für diese beeindruckende Rolle erhielt sie den Preis als beste Darstellerin beim Sao Paolo International Film Festival. Zudem wurde sie mit dem Förderpreis des deutschen Films für ihre Darstellungen in "Das Fremde in mir" und "Die Glücklichen" (2008, wieder unter der Regie von Schütte) ausgezeichnet.

Ebenfalls 2008 verfilmte Stephan Kimmig seine Inszenierung von Schillers "Maria Stuart" für das Fernsehen, in der Wolff die Titelrolle übernahm. In Schüttes dreiteiliger Fernsehserie "Koffie to go" (2010) wirkte sie ebenfalls mit. Im gleichen Jahr spielte sie dann zusammen mit Axel Milberg im Kieler Tatort "Borowski und der vierte Mann", bevor sie 2011 in Dominik Grafs Beitrag zur "Dreileben"-Trilogie, "Komm mir nicht nach" zu sehen war. In der Trilogie wird ein Kriminalfall von drei Regisseuren aus drei verschiedenen Perspektiven inszeniert.

2011 übernahm sie außerdem Nebenrollen in internationalen Produktionen, sowohl im italienischen Kriminaldrama "Tatanka" als auch in Paul W.S. Andersons Verfilmung von Dumas' "Die drei Musketiere", u.a. mit Christoph Waltz. Im deutsch-finnischen Drama "Fenster zum Sommer" spielte Wolff in einer Nebenrolle erneut eine Frau namens Rebecca.

Eine beeindruckende Leistung lieferte sie an der Seite von Tobias Moretti im Fernsehfilm "Mobbing" (2012) ab: Wolff gibt hier die Ehefrau eines Mannes, der nach 18 Jahren seine Arbeit verloren und nun mit Depressionen zu kämpfen hat, wodurch das heimische Familienleben aus der Bahn gerät. 2013 erhielt sie dafür den Deutschen Fernsehpreis als beste Darstellerin. 2014 folgte ein weiterer Auftritt in einem "Tatort", dieses Mal in der Kölner Episode "Der Fall Reinhardt" als unter Schock stehende Mutter, deren Kinder bei einem Brand ums Leben kamen. Ebenso sah man Wolff in Benjamin Heisenbergs Komödie "Über-Ich und Du" (2014) in einer Nebenrolle.

Aber auch im Theaterbereich blieb Wolff sehr aktiv. So sah man sie in zahlreichen Inszenierungen am Deutschen Theater Berlin, dessen Ensemble sie bis 2016 angehörte. Ebenfalls 2016 gab sie am Schauspiel Frankfurt ihr Theaterregiedebüt, mit der Produktion "Shoot / Katzelmacher / Repeat".

In der viel gelobten, von schwarzem Humor durchzogenen Miniserie "Morgen hör ich auf" (2016, TV) war sie die treulose Frau eines Familienvaters, der aus Finanznot zum brillanten Geldfälscher wird. Unter der Regie von Andreas Kleinert spielte sie die Titelrolle in der modernen Ibsen-Verfilmung "Hedda" (2016, TV). Im Wettbewerb der Berlinale 2017 feierte Volker Schlöndorffs "Rückkehr nach Montauk" Premiere, mit Susanne Wolff in einer zentralen Rolle als Ehefrau eines prominenten Schriftstellers, der eine alte Geliebte wiedertrifft.

Die Hauptrolle hatte Wolff auch in Wolfgang Fischers vielfach preisgekrönten Drama "Styx" (2018) als Alleinseglerin, die auf hoher See auf ein schwer beschädigtes, hoffnungslos überladenes Flüchtlingsboot trifft. Für diese Rolle erhielt sie unter anderem die Auszeichnung als beste Schauspielerin beim Deutschen Regiepreis Metropolis und den Günter Rohrbach Filmpreis. Beim Deutschen Filmpreis 2019 wurde sie für die Beste weibliche Hauptrolle ausgezeichnet.  

Weitere Hauptrollen hatte sie in Wolfgang Murnbergers skurriler TV-Komödie "Nichts zu verlieren" (2018), als um ihren kleinen Sohn kämpfende lesbische Mutter in dem Sorgerechts-Drama "Unser Kind" (2018) und als selbstzerstörerische Comicautorin in der niederländischen Charakterstudie "Bloody Marie" (2019). In "Geborgtes Weiß" (2021) spielte Wolff eine Ärztin, deren beschauliches Leben durch einen albanischen Flüchtling aus den Fugen gerät. Frauke Finsterwalder besetzte sie in der Titelrolle von "Sisi & ich" (DE/CH 2022).